Правила доставки в Референс-центр по боррелиозам проб биологического материала
В соответствии с приказом Роспотребнадзора № 1116 от 01 декабря 2017г. «О совершенствовании системы мониторинга, лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации» Референс-центр по мониторингу за боррелиозами (ФБУН Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций Роспотребнадзора) проводит исследования клинического и полевого материала, а также изолятов (штаммов) боррелий, изолятов ДНК возбудителя:
– материала от больных иксодовым клещевым боррелиозом (ИКБ): сывороток крови, ликвора, пробы суставной жидкости;
– подтверждение положительных проб иксодовых клещей, собранных в природных очагах и снятых с людей;
– генетическое типирование, секвенирование и анализ геномов штаммов возбудителя;
– микробиологическое исследование изолятов (штаммов) боррелий.
Материал поступает в Референс-центр из лабораторий ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъектах Российской Федерации, а также из филиалов ФГУЗ, лабораторий ЛПУ, проводящих исследования на ИКБ на закрепленной территории.
Забор, упаковку, передачу и транспортирование материала от пациентов с диагнозом ИКБ (сыворотки крови, ликвор, синовиальную жидкость), положительных проб полевого материала (иксодовых клещей) и снятых с людей переносчиков осуществляют в строгом соответствии с требованиями санитарно-эпидемиологических правил СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности», а также СП 3.1.3310-15 «Профилактика инфекций, передающихся иксодовыми клещами».
Материалом для микробиологического, серологического и молекулярно-генетического исследования являются кровь и ее фракции (плазма, лейкоцитарная фракция, сыворотка), спинномозговая жидкость, синовиальная жидкость, мозг погибших людей, иксодовые клещи (из природных очагов и снятых с населения).
Забор материала от больных проводится медицинскими работниками стационара, в который госпитализирован больной, прошедшими подготовку по биологической безопасности и правилам работы с клиническим материалом, подозрительным на заражение возбудителями инфекционных болезней III-IV групп патогенности. Секционный материал отбирают медицинские работники патологоанатомических отделений (бюро судебно-медицинской экспертизы). Транспортировка материала проводится с соблюдением «холодовой цепи».
Способы взятия, условия хранения и транспортирования клинического материла для углубленного изучения ИКБ приведены в приложениях.
Приложение 1
Способы взятия материала
- Кровь и ее фракции.
- Цельная кровь. Взятие цельной периферической крови проводят утром натощак или через 3 часа после приема пищи из локтевой вены одноразовым шприцем в объеме 5 мл в пробирку с 6 % ЭДТА из расчета 1:20. Пробирку закрывают крышкой (сиреневого цвета) и аккуратно переворачивают несколько раз для перемешивания крови и антикоагулянта.
Гепарин и цитрат натрия в качестве антикоагулянта не использовать!
Метод исследования: ОТ-ПЦР.
- Плазма крови. Взятие цельной периферической крови проводят утром натощак или через 3 часа после приема пищи из локтевой вены одноразовым шприцем в объеме 5 мл в пробирку с 6 % ЭДТА из расчета 1:20. Пробирку закрывают крышкой (сиреневого цвета) и аккуратно переворачивают несколько раз для перемешивания крови и антикоагулянта. Для отбора плазмы пробирку с кровью центрифугируют 10 минут при 3000g. Затем отбирают плазму крови.
Гепарин и цитрат натрия в качестве антикоагулянта не использовать!
Метод исследования: ПЦР.
- Сыворотка крови. Для получения сыворотки забор крови проводят утром натощак из локтевой вены одноразовым шприцем в объеме 5 мл в пробирку для серологических исследований без антикоагулянта (красная крышка).
Метод исследования: ИФА.
- Спинномозговая жидкость. Отбирают в случаях проведения пункции с лечебной или диагностической целью в количестве 2-3 мл, но не менее 1 мл, используя одноразовые иглы, в одноразовые пластиковые пробирки.
Метод исследования: ПЦР, ИФА, микробиологический.
- Секционный материал. Стерильно отбирают кусочки объемом 2-3 см3 из продолговатого мозга, ствола мозга, базальные ядра (подкорковые ядра), верхне-шейный и грудной отделы спинного мозга. Материал помещают в стерильные флаконы с притертыми (закручивающимися) крышками и транспортируют в условиях «холодовой цепи».
Метод исследования: ПЦР, ИФА, микробиологический.
Вскрытие и отбор проб необходимо проводить в течение первых суток после смерти!
Приложение 2
Условия хранения, транспортировки и предварительной обработки материала
Образцы цельной крови:
– при температуре 20-25 °С – в течение 2 часов;
– при температуре 2-8 °С – в течение 12 часов с момента взятия для качественного определения нуклеиновых кислот;
Недопустимо замораживание образцов цельной крови!
Образцы плазмы и сыворотки крови:
– при температуре 2-8 °С – в течение 5 суток;
– при температуре минус 20 °С – в течение года;
– при температуре минус 70 °С – длительно.
Допускается однократное замораживание-оттаивание материала, поэтому образцы плазмы или сыворотки для длительно хранения желательно разлить небольшими аликвотами (0,1 – 0,2 мл) в пробирки объемом 1,5 – 2,0 мл.
Спинномозговая жидкость:
– при температуре 2-8 °С – в течение суток;
– при температуре минус 20 °С – в течение недели;
– при температуре минус 70 °С – длительно.
Допускается однократное замораживание-оттаивание материала.
Секционный материал:
– при температуре 2-8 °С – в течение 3 суток;
– при температуре минус 20 °С – в течение недели;
– при температуре минус 70 °С – длительно.
Допускается однократное замораживание-оттаивание материала.
Хранение и транспортировка иксодовых клещей
Условия хранения собранного материала определяются характером последующих исследований и продолжительностью времени с момента сбора до проведения исследований. Методические требования к подготовке проб для исследований могут существенно различаться, что необходимо учитывать уже при хранении и транспортировке материала. Возможна доставка собранных для исследования клещей в стационарную лабораторию в живом виде, ЕСЛИ:
– время между сбором и исследованием составляет менее трёх недель;
-при транспортировке и хранении клещей возможно соблюдение благоприятных для них показателей температуры и влажности.
Возможны два способа хранения живых клещей:
- Если клещи были собраны в бинты: бинты с клещами увлажнить, сложить в предварительно подписанные полиэтиленовые пакеты с «замком», хранить в бытовом холодильнике при температуре около + 4 С (не замораживать!). В полевых условиях клещи в бинтах хранятся на холодном грунте, но при таком режиме хранения время доставки в лабораторию без ущерба для материала должно составлять не более недели.
- Хранение клещей в пробирках с дифференцированной влажностью: на дно стеклянной пробирки помещают умеренно увлажнённую, плотно утрамбованную вату (примерно на ¼ от размера пробирки), затем – сложенный вдоль «гармошкой» вкладыш из фильтровальной бумаги (он не должен соприкасаться с влажной ватой!). В подготовленную таким образом пробирку помещают клещей (не более 30–50 экз.) и закрывают сухой и плотной ватно-марлевой пробкой. Самцов и самок клещей следует помещать в разные пробирки (чтобы не допустить их копуляции, после которой самцы быстро гибнут). Хранят пробирки с клещами в горизонтальном положении на кювете в бытовом холодильнике при температуре от +4 С (сверху кювет с про-бирками прикрывают полиэтиленовой плёнкой для замедления испарения воды). Во время хранения необходимо периодически следить за уровнем увлажнения ватной пробки на дне пробирки (она не должна пересыхать). При появлении на стенках пробирки или на ватной пробке плесени клещей необходимо пересадить в новую пробирку. При таком режиме хранения возможно сохранение клещей в живом состоянии на протяжении нескольких месяцев.
Хранение и транспортировка суспензий клещей, снятых с пациентов
Суспензии иксодовых клещей, снятых с обратившихся лиц, оставшиеся после исследования на наличие антигена вируса КЭ, подлежат заморозке при -20С в пластиковых пробирках типа Эппендорф. Хранятся без размораживания до момента отправки. Упаковка и транспортировка материала для углубленного изучения, а также хранение осуществляются в соответствии СП 1.2.036-95. Соблюдая условия тройной упаковки и герметичности контейнер с материалом помещают в сумку-холодильник или во внешний термоконтейнер с хладагентами. Транспортировка (доставка) осуществляется спецсвязью (курьерской службой) или нарочным в условиях «холодовой цепи»: при температуре 0-4 °С – не более 3-х суток.